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Western blot常见问题分析

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Western blot常见问题分析

转印膜上蛋白样品量少

可能原因:

蛋白质上样量不足或蛋白样品中目的蛋白含量低

建议解决方案:

通过预实验确定最佳的上样量,保证目的蛋白的量在一抗的检测范围内

转膜效率低

1

可能原因:

转移缓冲pH值与目的蛋白的等电点相近,蛋白质所带的电荷不足以使蛋白泳动转移到膜上

建议解决方案:

调整转移缓冲液的pH值,使目的蛋白在该环境下带负电利于转移

2

可能原因:

蛋白质变性不充分

建议解决方案:

在转移缓冲液中加入SDS,利于蛋白质的变性和转移

3

可能原因:

转移过程中凝胶和转印膜之间存在气泡,使蛋白转移不完全

建议解决方案:

操作中使用表面光滑的玻璃棒彻底地赶走凝胶和转印膜之间的气泡

4

可能原因:

凝胶和转印膜两侧的滤纸过大互相接触,造成电流直接从滤纸通过,蛋白质没有转移的推动力

建议解决方案:

将凝胶和转印膜两侧的滤纸裁成与凝胶一般大小,对齐滤纸、转印膜及两侧滤纸的四边,避免彼此长出的边缘直接接触

5

可能原因:

转印膜过期或不适合

建议解决方案:

选用合适合格的转印膜

6

可能原因:

电压或电流过小

建议解决方案:

80-100V电压或20mA恒流

7

可能原因:

转印的时间过短

建议解决方案:

根据不同的转移装置保证转移的时间

8

可能原因:

蛋白转移过程中环境过热

建议解决方案:

应配备冷却装置,保证凝胶和膜处于20℃以下

显色过程中无条带出现

1

可能原因:

所使用的第一抗体、第二抗体及显色方法不合适

建议解决方案:

选择适于目的蛋白的第一抗体;适于第一抗体的第二抗体;适于第二抗体的显色方法

2

可能原因:

封闭液中起封闭作用的物质过浓

建议解决方案:

降低起封闭作用物质的浓度

3

可能原因:

目的条带含量低于一抗的检测灵敏度

建议解决方案:

使用合适方法增加目的条带的含量

4

可能原因:

一抗的效价低或稀释倍数过大

建议解决方案:

增加一抗的浓度即减少稀释倍数

5

可能原因:

二抗的效价低

建议解决方案:

增加二抗的浓度即减少稀释倍数

6

可能原因:

一抗或二抗的作用时间不足

建议解决方案:

相应的增加作用时间,以37℃作用的时间在1h以上

7

可能原因:

一抗或二抗后洗涤的时间和次数过长

建议解决方案:

减少洗涤的次数和时间,以37℃,5-10min,三次为好,可以酌情增减

8

可能原因:

二抗的显色时间过长

建议解决方案:

如果选用的是在短时间内褪色的二抗显色法应注意避光显色时间不宜太长,显色后立即拍照留图

显色背景过高

1

可能原因:

封闭液中封闭物质不足

建议解决方案:

增加起封闭作用的物质浓度

2

可能原因:

转印膜未能完全的被封闭液所覆盖,膜上的非蛋白样品的部位暴露未能被封闭物质占据

建议解决方案:

注意使封闭液完全的覆盖转印膜的第一部分

3

可能原因:

封闭的时间和温度不够

建议解决方案:

37℃下至少应轻轻振摇封闭1h以上

4

可能原因:

一抗为多克隆抗体,与非目的条带也有作用

建议解决方案:

适当的减少一抗的浓度和作用的时间,增加洗涤的次数

5

可能原因:

二抗浓度过高洗涤不彻底

建议解决方案:

降低二抗的浓度,适当增加洗涤的时间

6

可能原因:

化学显色底物过多

建议解决方案:

按照说明适量加入显色剂各种成分


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