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细胞凋亡检测

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是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。

一、流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI 双染色法

原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),用流式细 胞仪即可检测凋亡细胞。细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏;Annexin V染色法不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DN****段丢失。因此,Annexin V法更加省时,简单,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

实验步骤
(1) 用 PBS 洗细胞培养板两次,然后用胰酶消化,1000 rpm 离心 5 min,弃去培养液
(2) 各管加入 10 mL PBS,轻柔地悬浮细胞,洗细胞两次
(3) 计数1x105细胞放入100ul  1X Binding Buffer,放入1.5ml EP管
(4) ANNEXIN V 5ul先孵育20min,再加入PI 3ul 再孵10min,室温避光
(5) 加入400ul Binding Buffer,流式细胞仪分析细胞凋亡情况

实验实例:
诱导凋亡药物紫杉醇处理乳腺癌MCF7细胞8小时后,消化并收集细胞,用PBS洗涤细胞三次,加入annexin V-APC染色,流式细胞仪检测。

左图为对照组,右图为加药处理组

二、TUNEL
 
基本原理:
TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
 
操作流程图:

实验步骤
1)、清洗:移去完全培养基,用 PBS 清洗一次细胞。 
2)、固定:用 4%的多聚甲醛在室温固定 15 分钟。 
3)、清洗:用 PBS 在室温漂洗三次,每次 10 分钟。 
4)、破膜:用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室温通透化处理 15 分钟。 
5)、清洗:用 PBS 在室温漂洗三次,每次 10 分钟。 
6)、封闭:用含 5%山羊血清(BSA)的 PBS 在室温封闭 1 小时。 
7)、清洗:TBST室温漂洗三次,每次10分钟。
8)、TUNEL溶液配制:Enzyme Solution和Label Solution以1:10混匀,避光备用,注意试剂用量,试剂盒价格昂贵,避免浪费。
9)、标记:用上诉配好的溶液,约20ul每张玻片,室温避光孵育10分钟,
10)、清洗:用PBS在室温漂洗三次,每次 10 分钟。 
11)、DAPI染核:加入 DAPI 染色液 1:2000 室温孵育 5 分钟。 
12)、清洗:用PBS 在室温漂洗三次,每次 10 分钟。 
13)、封片:用封片剂封片,在荧光显微镜下观察结果,免疫荧光照片用蔡司共聚焦显微镜。
14)、TUNEL positive dot 计算方法:DAPI和TUNEL positive dot 通过image pro软件,计算DAPI的阳性点作为细胞总数,TUNEL阳性点作为tunel点,最后计算 TUNEL/DAPI×100%作为凋亡细胞的比率。


实验结果图实例:

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