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Western Blot即蛋白免疫印迹,是根据抗原抗体的特异性结合检测样品中目的蛋白的方法。这种技术是把SDS-PAGE电泳分离的蛋白组分从凝胶转移到一种固相载体(如PVDF或NC膜)上,以针对某种或某类蛋白的特异性抗体与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应,再与酶标记的第二抗体反应,经过底物显色以检测特异性蛋白的表达水平。
由于Western Blot技术操作简便,目前该技术广泛用于蛋白表达水平的检测,对蛋白进行定性和半定量分析。

技术优势
(1)高效蛋白提取液进行高质量蛋白的提取,同时高效的蛋白酶抑制剂有效防止蛋白的降解及去磷酸化等作用;
(2)拥有多年的Western Blot检测经验,为客户提供专业的技术服务。
(3)安提海拉为客户设置预实验,根据客户样品具体情况摸索最适上样量和抗体最适稀释度。
 
样品要求
 
客户需提供新鲜或正确保存的蛋白样品或者蛋白提取液,阳性对照样品(细胞或组织), 检测目的蛋白的一抗(或由汉恒生物代购)。样品要求为: 
1、细胞不少于5×106个; 
2、组织样品不少于50mg;
3、总蛋白浓度不低于 2μg/μl(至少50μl)。
 
 
 
实验内容
1、蛋白提取和定量(如果提供蛋白样品,则直接电泳预实验检测抗体特异性);
2、SDS-PAGE 10-15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;
3、转膜(PVDF膜);
4、封闭(5%脱脂奶粉);
5、一抗孵育(其中内参基因为Tubulin、GAPDH或Actin);
6、二抗孵育(如果由于材料降解或一抗造成实验无法继续,则收取相关预实验费用);
7、显色(ECL);
8、曝光、洗片、分析。
 
提供产品内容
蛋白浓度,扫描图,以及灰度分析(如果需要)及完整实验报告。
 
 
注意事项
每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。一般状况下,2周即可完成实验。如遇特殊情况,如一抗不好,蛋白浓度低或蛋白特殊,如分子量大等,周期会有所延长。
 
 Western Blot细胞蛋白样本的准备及运输 
去掉培养液,用PBS洗一次后,加入少量PBS,用细胞刮将细胞刮下,用1ml枪吸取细胞易于1.5ml EP管中,快速离心(升至最高转速就可stop)去除上清后,可按下面两种方法运输:

1、细胞干运输:将细胞干放入液氮速冻,-80℃保存; 如需长途过夜运输,建议干冰运输;如当天送达样本,可用液氮或者-80冰袋运输。
 
2、细胞裂解液运输:加入一定量的胞裂解液后即可冷藏运输(冰袋或者冰盒)。如需检测磷酸化蛋白,建议裂解液中加入磷酸酶抑制剂,抑制磷酸酶活性,保护蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白,则置于冰上裂解1 h,12000rpm离心10 min后取上清,即为蛋白样本。蛋白样本可-20度冷藏运输(建议快递寄送用干冰或者足量-80度冰袋),保存需要-80℃。
 
3、蛋白样本运输
注意:蛋白样本需要经过浓度测定,再进行变性,变性时先加入Sample buffer,再95℃10min,Sample buffer可防止变性导致的蛋白沉淀析出。变性的蛋白可直接冷藏运输,-20℃稳定保存。
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