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RIP

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RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip,帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。

RIP 实验基本原理:
1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
2. 防止非特异性的RNA的结合。
3. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
4.结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
95%的人类基因组并不编码基因,而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用,与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关,并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控,包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程,因此,对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此,RNA研究也被越来越多的科学家重视起来,目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域,而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法,帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。

RIP实验详细操作步骤:
一. 细胞裂解液获取
      A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
      1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
      2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff管
      3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
      4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min
      5. 每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃
      B.  悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解
      C.  组织样品处理
      1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次
      2. 加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数
      3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
      4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min

      5. 每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃


 二.  磁珠的准备
      A. 实验前准备
      1、enpendoff管
      2、磁力架
      3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上
      4、抗体,置于冰上
      5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC水
      B. 磁珠准备过程
     1. 重悬磁珠
      2. 标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照
      3. 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管
      4. 每管加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡
      5. 将enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次
      6. 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠,加入约5ug相应抗体于每个样品中
      7. 室温孵育30min
      8. 将enpendoff管置于磁力架上,弃上清
      9. 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次

      10. 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上


三.  RNA结合蛋白免疫沉淀
      A. 准备工作
      1、冰盒
      2、360°旋转仪
      3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
      B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程
      1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer
      2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
      3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,14,000rpm,4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml
      4. 4℃孵育3h至过夜
      5. 短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清

      6. 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次


 四、RNA纯化
      A. 实验前准备
      1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min,喷DEPC水以除RNA酶
      2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
      3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇
      4.DEPC水置于冰上
      5. 离心机预冷
      6. 冰盒
      B. RNA纯化过程
      1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
      2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
      3. 55℃孵育30min
      4. 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中
      5. 于每管上清液中加入250μlRIP Wash Buffer
      6. 于每管加入400μl苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
      7. 小心的吸取350μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
      8. 于每管加入400μl氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
      9. 小心的吸取300μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
      10. 每管加入50μl Salt SolutionⅠ,15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ,850μl 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持1h至过夜
      11. 14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清
      12. 用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干.
      13. 10-20μl DEPC水溶解,-80℃保存,送测序
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