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腺病毒技术服务

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腺病毒(Adenovirus,AdV)是一种无包膜的线性双链DNA病毒,基因组长约35000 bp,理论上可编码22~40个基因,两端各有长约100~150bp的末端反向重复序列(ITR),在其左端ITR3,端为长约300bp的包装信号(Ψ)。病毒颗粒直径约80~110 nm,病毒衣壳有252个壳粒,呈规则的正二十面体面体结构,其中包括240个六联体和12个位于正二十面体顶部的五联体构成。
腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒,在自然界中广泛分布。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染,但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的,对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。
利用基因工程手段将腺病毒基因组DNA改造成多种基因操作表达载体,目前常用的腺病毒包装系统有:AdMax系统和AdEasyTM系统。


AdEasyTM包装系统 
AdEasyTM 包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌(BJ5183)中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程,获得环状的重组腺病毒基因组,并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染HEK293细胞,避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。
使用这个系统需要注意以下问题: 
(1) 要用能表达Cre重组酶的特定的大肠杆菌,建议建立菌种库以免细菌发生变化;
(2) 由于重组是在细菌中发生的,微小的基因组变化不易发现; 
(3) 要获得高品质的重组腺病毒毒种(高病毒产量、高目的基因表达)应挑选多个重组腺病毒质粒,分别转染HEK293细胞,获得多个重组病毒来筛选。


AdMax包装系统 
AdMax包装系统是通过Cre/loxP 获得重组病毒,这个过程发生在HEK293细胞中,从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染HEK293细胞,利用Cre/loxP系统的作用实现重组,产生重组腺病毒。这个系统有多种优势,包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高(因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍)等。 
与AdEasy系统相比,AdMax系统有一定的优势:只需要3~4周就能完成从质粒构建到重组出毒,成功率大于98%(其中95%的克隆含有目的基因),因在真核细胞内重组出毒,保持了对腺病毒的生存压力,有助于重组腺病毒的基因组的完整性;而AdEasy系统的出毒成功率只有18~34%(Stratagene公司新版的AdEasy XL系统成功率在94%左右),且在细菌(BJ5183)中完成病毒基因组重组,理论上,失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变,病毒遗传背景及活性可能会受到影响。鉴于这些特点,本公司使用AdMax包装系统制备腺病毒。

腺病毒载体有下列优点:
1、腺病毒的基因结构与功能研究的比较清楚;
2、可装入基因的容量较大(8K);
3、转染范围广,转染率较高,所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力;
4、不整合到靶细胞基因组,无插入突变,无致癌性,对人无致病、致畸、致癌的潜在危害;
5、可以复制出滴度高(可以达到1011 pfu/mL)、稳定性好、基因转移效率高的病毒;
6、适用于在难以转染的细胞中进行的RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和In Vivo实验。

技术路线: 

1. 病毒包装与鉴定:
1) 转染前一天,将细胞接种到6孔板中,控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板,去除原有细胞培养基,加入1.5ml的Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物: 
a) 将待转染的病毒载体质粒4μg(骨架质粒:穿梭质粒=1:1)溶于Opti-MEM培养基,总体积为250 μl,轻轻混匀。
b) 将Lipofectamin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基,总体积为250 μl,轻轻混匀。
c) 将Lipofectamin2000装转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置20min,使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
d) 取出细胞培养板,将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中,做好标记,放回培养箱。
e) 6h后吸去培养基,PBS洗一次,加入2ml新鲜完全培养基培养。
f) 每三天换液一次,大概7-15天左右出现病毒空斑,待完全病变后收集上清液。
2. 病毒大量扩增与纯化:
将HEK293细胞铺于30-40个10cm dish,待细胞长至70-80%,每块板加入合适滴度的病毒(约107-108PFU/ml)10 µl,感染细胞,待细胞全部病变后(2-3天),每块板中加入约500 µl 10% Nonidet P 40(NP40)以裂解细胞。收集细胞裂解物,12000 rpm离心10 min,弃细胞碎片收集上清。每100ml上清加入50 ml病毒沉淀液(20% PEG8000,2.5M NaCl),冰上放置1h以沉淀病毒。12000 rpm离心上述混合物20min,弃上清,将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20 mM Tris-HCl,pH 8.0)4℃ 7000rpm离心5min,收集病毒悬浮液。
在超速离心管中加入2.0 ml的1.40g/ml CsCl 溶液(溶剂同上)。再加入3.0 ml 1.30 g/ml 的CsCl 溶液。最后加入5 ml的病毒悬浮液。22800 rpm,4℃离心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min)。在透析缓冲液(50g蔗糖,10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液,2ml 1M MgCl2溶液定容至1000ml)中,4℃透析过夜,中间更换透析液一次。收集病毒,于-80℃保存。
三种密度的CsCl溶液配制如下(溶于灭菌20 mM Tris,pH8.0),4℃保存。

3. 病毒滴定测定:
1) 选取状态良好的HEK293细胞,使用完全培养基重悬细胞,制备成5.0×105个/ml的细胞悬液,24孔板每个孔中种入1ml细胞,
37℃、5%CO2培养。
2) 准备好10倍梯度稀释的病毒样品,然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中,每孔加入100μl。
3) 37℃、5%CO2感染48h。轻轻的去除培养液,沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇500μl,-20℃固定20min。
4) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5min。
5) 加入200μl 1%BSA 37℃封闭1h。
6) 加入200μl的一抗溶液至每个孔中,37℃孵育1h。
7) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5min。
8) 加入200μl的二抗至每孔,37℃孵育1h。
9) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5min。
10) 加入200μl新配置的工作液至每孔,室温孵育5-10min。
11) 弃工作液,使用PBS清洗2次,每孔每次加入1ml PBS。
12) 每孔随机选择5个视野,使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
13) 计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。

服务流程:

客户提供 签订合同支付预付款→ 生物服务 交付结果交付尾款→ 客户得到
目的基因序列信息
腺病毒载体构建
与合同对应的病毒量以及对照病毒
病毒载体要求
病毒包装纯化
详细的实验报告
其它要求
滴度测定等



提供的腺病毒:
1) 采用5型E1/E3缺陷型腺病毒,生物安全性更高;
(2) 最新的AdMAX系统,病毒生产更快捷;
(3) 有多种过表达和shRNA腺病毒穿梭载体;
(4) 可带有荧光标记基因(GFP、RFP、YFP等),有多种启动子可更换;
(5) 包装空间大,最高可插入8K目的基因。
(6) 采用Cscl纯化工艺,纯度更高,滴度高达1010~1011 pfu/mL。

产品运输储存
对于长距离运输,应先将腺病毒载体保存在-80℃,再采用全程干冰运输,以防滴度下降。收到产品后,请第一时间在 BL2 生物安全柜中根据实验所需量将病毒进行分装。分装病毒 时请将病毒始终放置在冰上。分装的病毒可在 4 ℃保存 3 天,其余病毒请于-80 ℃冰箱 冻存。请避免反复冻融,否则会降低病毒滴度!

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