服务热线:18616635231

技术服务

慢病毒包装技术服务

产品介绍【返回】

慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入,对其生物学特性最为了解,因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。


图1 HIV-1 RNA结构图
HIV-1为双链RNA病毒,共有9个基因,如图1所示。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构,tat、rev为调节基因,vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因。其中,gag基因编码病毒的核心蛋白,包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白;pol基因编码病毒复制所需的酶,如反转录酶、整合酶、蛋白酶,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平,tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。4个辅助基因编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序列(LTR),内含复制所需的顺式作用元件,如包装信号元件Ψ。
第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表,该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代,3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上,一个表达gag和pol,另一个表达env。载体质粒携带了5’端LTR,和全部5’端非翻译区域,另外还带有rev应答元件(RRE)。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。
第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进,在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力,同时增加了载体的安全性。
第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。同时又增加了两个安全特性:一是构建自身失活的慢病毒载体,即删除了U3区的3′LTR,使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因,用异源启动子序列代替,这样原始的HIV-1基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

慢病毒优点
1 宿主范围广  包装病毒时用VSV-G基因代替了原病毒的env基因,宿主范围更广,如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。 
2 感染能力强  慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,能感染绝大多数细胞,对一些难于转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞有较好的感染效率。    
3 具有整合能力  慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,因此可用于构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞株,也可以用于制备转基因动物。 


整体实验流程

慢病毒包装技术路线:


包装过程:
1) 转染前一天,将细胞接种到100mm dish中,控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板,去除原有细胞培养基,加入10ml的Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物: 
n 将待转染的病毒载体质粒32μg(骨架质粒:穿梭质粒=1:1)溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置20min,使DNA和Lipofectmin2000转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
n 取出细胞培养板,将上面配好的DNA- Lipofectmin2000转染试剂复合体加入到细胞培养板中,做好标记,放回培养箱。
n 6h后吸去培养基,PBS洗一次,加入10ml新鲜完全培养基培养。

收毒:
1) 转染48h后,第一次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,并给细胞更换新鲜的完全培养基。
2) 转染72h后,第二次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,丢弃细胞。
注:废弃的含病毒的培养基加入84消毒液(1:20左右),浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头,离心管,培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理,也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌(121℃,30min)处理。

3。 慢病毒纯化:
1) 普通离心机:3500rpm,10min,RT离心后,上清马上倒入新的50ml离心管,0.45μm,过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管,两两对应配平衡,不够的体积可用不含血清的培养基配平。
2) 超速离心机:HITACHI,30,000rpm,2h,4℃,离心后,可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀,做上记号。在安全柜中,打开离心管,小心地弃上清,离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上,弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS,80μl-120μl/管,用封口膜封住管口,4℃溶解沉淀过夜。
3) 将同一种病毒,逐管收集法收集病毒到最后一管,再用100μl DPBS收集2次,全部收到1.5ml 离心管中,按要求分装病毒,标记(病毒名称,年-月-日)-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度检测(Real time 定量PCR 法测定滴度):
1) 样品制备:
a) 消化293T细胞,按1×105细胞每孔接种24孔板。
b) 细胞贴壁后(铺板后4~6h)加入病毒。
c) 12~20h后换液,去掉含病毒的培养基。
d) 感染后72h拍照记录荧光,收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
2) Real-time PCR 检测:
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。
a) 下列比例配置反应体系:


b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃,15s,之后每一步变性95℃,5s,退火延伸60℃,34s,共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95。0 ℃ for 00:15。
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60。0 ℃ for 00:34。
Data collection and real-time analysis enabled。
c) 制作熔解曲线。PCR 结束后, 在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30s, 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95。0 ℃ for 01:00。
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0。5 ℃

服务流程:

客户提供 签订合同支付预付款→ 上海觅拓生物 交付结果交付尾款→ 客户得到
目的基因序列信息
腺病毒载体构建
与合同对应的病毒量以及对照病毒
病毒载体要求
病毒包装纯化
详细的实验报告
其它要求
滴度测定等


上海觅拓生物提供的慢病毒

我们采用第三代4质粒慢病毒包装系统,生物安全性更高; 

采用VSV-G包膜,宿主范围更广; 
产生的慢病毒滴度高,可达108~1010TU/mL; 
各种慢病毒穿梭载体可供选择:过表达、ShRNA、miRNA、Tet诱导表达载体等; 
可带有荧光报告基因(GFP、RFP、mCherry、Luciferase等)和药筛标记基因(Puromycin、Neomycin、Hygromycin等),有多种启动子(CMV、PGK、CAG、Ubc等)可供选择; 
3~4周内即可完成病毒包装服务。

运输和储存 
对于长距离运输,应先将慢病毒载体保存在-80℃,再采用全程干冰运输,以防滴度下降。 
慢病毒载体在-80℃保存6个月,滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品,进行实验前,重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融(小于3次)。 
使用前从-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴锅中,轻轻晃动,使其尽快溶解,操作过程应置于冰盒上进行。用不完的毒可以暂时放在4℃冰箱中,但最好尽快用完。


点击关闭

  • 微博

    微信
关于我们
公司动态
细胞产品
建系细胞
原代细胞
实验用干细胞
质粒,载体
感受态细胞
试剂耗材
细胞培养试剂
胎牛血清Gibco,Hyclone,sigma
支原体检测与清除
试剂盒
外泌体研究
核酸提取
PCR及RT-PCR产品
抑制剂
其他
克隆载体及其相关产品
电泳相关产品
蛋白质研究相关
仪器设备
细胞电穿孔仪
离心机
移液器
耗材
技术服务
分子生物学技术服
细胞生物学技术服务
蛋白相关技术服务
病毒类技术服务
动物实验类技术服务
组织形态学技术服务
实验经验交流
联系我们
公司简介
联系方式
采购平台与展示渠道
人才招聘
安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三 安徽快三